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1. Data import
选择 mzML/mzXML 文件和样品信息，检查分组，点击 Import raw files。这一步登记原始文件，不执行色谱峰检测。
使用目录导入时，子目录可以参与分组；使用单独文件选择时应通过样品信息确认真实分组。检查导入表，不要将文件存放方式误当作生物学设计。
2. Raw data processing
软件使用 massprocesser/XCMS 相关处理功能，进行峰检测、保留时间校正和跨样品特征分组；是否补峰由设置决定。
重点检查：
| 参数类别 | 检查目的 |
|---|---|
| m/z tolerance | 与仪器质量精度相符 |
| Peak width range | 与实际色谱峰宽相符 |
| Signal / noise、noise、prefilter | 控制噪声和低质量信号进入峰表 |
| Grouping bandwidth、minimum fraction | 控制跨样品分组条件 |
| Fill peaks | 决定是否执行补峰，不等同于后面的矩阵缺失值填补 |
| Worker processes | 控制并行规模，同时考虑内存和数据量 |
先运行 Parameter trial 检查几个样品，确认后点击 Process raw data 处理完整数据。试跑不能代替正式步骤。
结果包括 mass_dataset、峰表和处理输出。需要查看生成文件时点击 Project folder，结合该次运行 ID 定位文件。
3. Data exploration
检查 m/z–RT 分布、样品及 feature 缺失值、分组和批次信息。在联动工作台选择 feature，查看峰形、MS1/MS2、样品强度及可用的注释证据。
Feature filters 改变当前显示范围，不删除下游数据；人工 Exclude 标记也不是自动从分析矩阵移除。详见 结果审查。
4. Data cleaning
按研究设计选择：
- 缺失值过滤，包括 QC 或生物学组内条件。
- 异常样品检查及明确的移除选择。
- 缺失值填补。
- 归一化。
- 可选的批次整合。
没有定量 QC 时，不要启用依赖 QC 的过滤或校正。异常点需要结合实验记录判断，不能仅凭 PCA 位置决定删除。
检查每一步的设置与前后结果。前后 PCA 可能是分别拟合的模型，坐标轴不能被理解为同一个固定坐标系。
5. Metabolite annotation
选择 metid 支持的参考数据库，配置离子模式、色谱类型、加合物、MS1/MS2 容差和匹配阈值。只有数据库 RT 与实验条件相容时才使用 RT 匹配。
在注释表中选择候选项，检查实验与参考 MS2 镜像谱，以及质量误差、RT 和其他证据。没有 MS2 的候选不能被解释为 MS2 已验证鉴定。
若暂不做注释，可在界面允许时选择 Skip annotation for statistics。跳过后仍可继续统计，但基于注释的 pathway analysis 需要先补做注释并更新其后步骤。
6. Statistical analysis
检查 PCA 和所需的差异分析设置。明确选择 Control 与 Treatment 等实际比较组。
配对分析需要正确的个体列，并保证两组中每个参与比较的个体各有一个样品且标识匹配。不能靠样品顺序自动推断配对。
7. Pathway analysis
确认注释 ID、候选歧义处理、输入筛选和背景集。根据研究目的选择合适的方法和多重检验设置。
没有符合要求的化合物时，空结果可能是合理结果；先检查输入筛选、注释与数据库覆盖，不要为了得到通路而随意放宽条件。
8. Results & export
选择运行范围和导出内容，保存完整表格、R 对象、代码和日志。详见 导出与恢复。
中断、继续与重跑
完成步骤保存在项目中。重开项目后可以从第一个尚未完成且前置条件满足的步骤继续，不必重跑已完成步骤。
重跑上游步骤成功后，依赖旧结果的下游步骤会变为过期，需要重新运行。旧结果仍在 Run history 中。失败或取消的重试不会把之前成功的结果当作新结果覆盖掉。
这里的恢复是从已保存的步骤继续，不代表可以从某一次峰检测内部的任意扫描点恢复。